Durant le prologue, Mercure demande à la Nuit de retarder la naissance du Jour, car Jupiter a rendu visite à une mortelle, Alcmène, femme du général thébain Amphitryon; ce dernier étant parti pour la guerre, le maître des Dieux a pris ses traits pour abuser sa femme. Chargé d'une ambassade auprès d'Alcmène, Sosie, le valet d'Amphitryon, est chassé de la demeure de son maître par Mercure, qui a également pris ses traits. A l'intérieur, Jupiter fait ses adieux à Alcmène, en lui demandant d'être aimé comme un amant et pas seulement comme un époux, différence subtile qu'elle conçoit mal. De son côté, Cléanthis, la femme de Sosie querelle Mercure, qu'elle prend pour son mari, en raison de l'indifférence dont il fait preuve à son égard.

Amphitryon de retour met sur le compte de l'ivrognerie le récit incohérent de son valet, et se prend de querelle avec Alcmène, étonnée de le voir "si tôt de retour". Sosie, sans avouer le dédoublement de Mercure, essaie de savoir de sa femme si celui-ci n'a pas trop profité de la situation. Jupiter reparaît et parvient à se réconcilier avec Alcmène.

Harcelé par des fâcheux, Amphitryon s'avoue profondément troublé par la situation, d'autant que Mercure-Sosie lui interdit ensuite l'entrée de sa propre demeure, car Jupiter – sous l'apparence d'Amphitryon – se trouve en ce moment avec Alcmène. Sosie, de retour, échappe à une bastonnade et réussit à prouver à son maître qu'il n'y est pour rien. Jupiter paraît et convainc l'assistance qu'il est le véritable Amphitryon. Enfin, après quelques péripéties, Mercure se présente sous ses propres traits et explique le mystère; le maître des Dieux, à son tour, annonce à Amphitryon que sa femme donnera naissance à un enfant, Hercule, dont les exploits étonneront l'Univers.